人工骨修復兔橈骨缺損的臨床研究
來源：未知 |發布時間：2022-12-19 10:14|點擊:次
人工骨修復兔橈骨缺損的臨床研究
骨缺損是臨床上常見的一種疾病，主要表現為骨結構的完整性被破壞，是目前骨科臨床治療的難題之一。創傷、感染、腫瘤、骨髓炎手術清創以及各種先天性疾病是導致骨缺損的主要原因。如何對各種原因引起的骨缺損進行有效的修復是現階段研究的主要方向。
低氧誘導因子-1（hypoxia?inducible factor?1,HIF?1）是Semenza等于1992年發現的一種氧依賴轉錄激活因子，通過與低氧反應元件（HRE）結合，引發下游基因轉錄，通過對其下游靶基因的誘導表達，調控血管生成、能量代謝、細胞增殖遷移分化等反應。大量體外和體內實驗研究報道都證實了HIF?1α在促進血管化及成骨化方面有著積極的作用。張勁娥等構建了野生型和點突變型HIF?1α基因慢病毒真核表達載體，并轉染兔骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs），發現其轉染后可促進兔BMSCs成骨基因的表達。Ding等將HIF?1α基因轉染到BMSCs中，并移植入早期激素性股骨頭壞死家兔模型中，結果表明HIF?1α基因轉染可提高離體骨髓細胞成骨相關基因mRNA的表達，在體外增強成骨細胞的活性，在體內增強血管生成活性，說明HIF?1α轉基因自體骨髓干細胞轉移可以促進激素性股骨頭壞死區的修復。
BMSCs是存在于骨髓中的一類非造血干細胞，在一定條件下可定向分化為多種細胞，如脂肪細胞、軟骨細胞或成骨細胞等。納米羥基磷灰石（nano?hydroxyapatite,nano?HA）是目前應用廣泛的一種生物活性材料，具有良好的骨傳導性和生物相容性。本研究將重組HIF?1α慢病毒質粒感染BMSCs后，與nano?HA人工骨復合培養，使骨修復材料具備良好骨傳導和骨誘導性能，并通過動物實驗對復合人工骨的修復能力進行檢測，以此解決人工骨修復材料在骨缺損區與周邊自體骨之間有效“骨整合”的難題，從而為臨床修復骨缺損提供一些實驗依據。
材料與方法
一、材料與試劑
慢病毒HIF?1α表達質粒、293T細胞、nano?HA人工骨（孔隙直徑為150~300μm、孔隙率為92%以上）由深圳市第二人民醫院組織工程實驗室制備提供；新西蘭大白兔，雄雌不限，2月齡（2 kg左右），由深圳市疾病預防控制中心提供。
Lenti?Pac HIV表達包裝試劑盒，H?DMEM培養基、PBS緩沖液，Opti?MEMI、0.25%Trypsin?EDTA、胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素+鏈霉素）、噻唑藍、二甲基亞砜，Anti?CD90/FITC、Anti?CD105/FITC、Anti?CD45/FITC、Anti?CD34/FITC、維生素C、3-甘油磷酸鈉、地塞米松、胰島素、戊巴比妥鈉、番紅、素木精、快綠。
二、兔BMSCs的分離、培養和鑒定
1.分離和培養新西蘭大白兔靜脈注射2%戊巴比妥鈉，全身麻醉，局部去毛、消毒，于兔后腿股骨大轉子處行骨髓穿刺，將5 ml注射器預裝0.1 ml肝素，抽取約3 ml骨髓。離心、洗滌。將洗滌后的細胞懸液加入5 ml含有10%FBS、1%雙抗的H?DMEM培養液中，置于直徑75 mm的培養皿中，5%CO 2和37℃培養箱中培養。48 h后首次換液，之后每2~3 d換液1次。
2.形態鑒定待貼壁生長的細胞集落達到85%~90%融合時，用0.25%胰酶消化細胞，按1∶2比例傳代培養，每2~3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。
3.表面標記鑒定取第3代生長狀態良好、處于對數生長期的兔BMSCs。洗滌，離心，計數，將細胞濃度調整為5×10 6個/ml。取100μl細胞懸液，分別加入20μl Anti?CD90/FITC、Anti?CD105/FITC、Anti?CD45/FITC、Anti?CD34/FITC，避光室溫孵育20 min，PBS液洗滌細胞，1 000 r/min，離心5 min。加入PBS液400μl，重懸細胞，流式細胞儀進行檢測，使用Beckman Coulter軟件采集數據。
使用Beckman Coulter軟件采集數據。
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